Лабораторные методы оценки т и в систем иммунитета в клинике

Ф КГМУ 4/3-07/02

ПП КГМУ 4/02

КАРАГАНДИНСКИЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

Кафедра иммунологии и аллергологии

Методические указания для самостоятельной работы студентов

под руководством преподавателя

Тема: Лабораторные методы оценки Т— и В-систем иммунитета в клинике. Лабораторные методы оценки системы комплемента и фагоцитарной системы. Анализ иммунограммы

По дисциплине: Общая иммунология

Для специальности: 5В130100- Общая медицина

Курс: 3

Составитель доц. Тимченко Н.А.

Караганда 2014 г.

Обсуждены и утверждены

на заседании кафедры иммунологии и аллергологии

Протокол № __ от ___.___. 2014 г.

Зав. кафедрой иммунологии и аллергологии, д.м.н., доцент _______ Газалиева М.А.

Тема: Лабораторные методы оценки Т- и В-систем иммунитета в клинике. Лабораторные методы оценки системы комплемента и фагоцитарной системы. Анализ иммунограммы

Цель:

  1. изучить принцип метода подсчета Т и В лимфоцитов в крови

  2. изучить принцип метода реакции бласттрансформации

  3. разобрать исследование антителогенеза

  4. разобрать основные рецепторы дифференцировки :

  • Fc-рецепторы

  • Рецепторы к комплементу (В-лимфоциты)

  • Поверхностные специфические рецепторы для распознавания;

Задачи обучения:

  • изучить роль иммунной системы в поддержании генетического постоянства внутренней среды организма, механизмов иммунологического распознавания и регуляции отдельных звеньев иммунологического ответа на молекулярном и клеточном уровне;

  • ознакомить с современными представлениями о роли цитокинов, гормонов и нейропептидов в регуляции иммунитета;

  • изучить иммунологические механизмы, лежащие в основе патогенеза аутоиммунной патологии, гиперчувствительности, отторжения трансплантата, опухолевого роста;

  • изучить причины и механизмы возникновения иммунодефицитных состояний;

  • изучение методов оценки иммунного статуса человека в клинике;

Форма проведения:

Семинар (обсуждение теоретических вопросов по теме занятия, проверка оформления выполненных заданий).

Задания по теме: подготовить презентацию и ответить на вопросы и тесты по теме занятия.

• Раздаточный материал (приложение 5)

• Литература

Основная

  1. Земсков А.М. – Клиническая иммунология. – Москва, 2006

  2. Р.М Хаитов – Иммунология- ГЭОТАР –Медиа, М., 2006

  3. А.В. Караулов – Наглядная иммунология — ГЭОТАР –Медиа, М., 2008

  4. Беклемишев Н.Д. — Аллергия, иммунитет и иммунокоррекция. — Алматы, Гылым, 1995

  5. Белозеров Е.С., Мошкевич Е.С., Шортанбаев А.А.- «Клиническая иммунология и аллергология»- Алматы,1992

  6. Петров Р.В. -«Иммунология»- М., Медицина.1987.

  7. Лебедев К.А., Понякина И.Д.-» Иммунная недостаточность «.- М., Наука, 2003

Дополнительная

  1. Беклемишев Н.Д., Цой И. Г.- Иммунопатогенез в инфекционном процессе» -Алматы, 1995 г.

  2. Адо А.Д.- Частная аллергология.- М., Медицина,1976

  3. Пыцкий В.И., Адрианова.- Аллергологические заболевания.- М.,Медицина,1984,1991.

  4. Г.Б. Федосеев.- Аллергология. (в 2-х томах).- Петербург, 2001

  5. Федосеева В.Н., Порядин Г.В., Ковальчук Л.В.- Руководство по иммунологическим и аллергическим методам в гигиенических исследованиях. — М.,Медицина,1993

>

Контроль:

Основные вопросы темы:

1. Основные вопросы темы:

  1. метод подсчета Т и В лимфоцитов в крови

  2. метод реакции бласттрансформации

  3. исследование антителогенеза

  4. основные рецепторы дифференцировки :

Тесты

1. При синдроме приобретенного иммунодефицита

а) не нарушается функция фагоцитоза

б) не реакции гуморального иммунитета

в) нарушены реакции клеточного иммунитета

г) не нарушается синтез комплемента

д) не нарушается синтез Ig

2. Выработка монокинов — это функция:

а) комплемента

б) В-лимфоцитов

в) моноцитов

г) Т-лимфоцитов

д) эозинофилов

3. Интерлейкин-2 — это:

а) клеточный компонент иммунной системы

б) неспецифический фактор

в) специфический фактор

г) компонент комплемента

д) все перечисленное

4. Структура Т- лимфоцита, распознающая антиген, представляет собой:

а) комплекс, состоящий из иммуноглобулиновых рецепторов и молекулы CD3

б) комплекс, состоящий из Т-клеточного рецептора и молекулы CD3

в) рецепторы иммуноглобулиновой природы

г) Ia-антиген

д) Т-клеточный рецептор

5. Иммуноглобулины синтезируются и секретируются:

а) Т-лимфоцитами

б) нейтрофилами

в) плазматическими клетками

г) макрофагами

д) всеми перечисленными клетками

6. В ходе иммунного ответа осуществляется кооперация между:

а) макрофагами, Т — и В-лимфоцитами

б) макрофагами и В-лимфоцитами

в) макрофагами, тимоцитами и В-лимоцитами

г) макрофагами и Т-лимфоцитами

д) Т-лимфоцитами, В-лимфоцитами и плазматическими клетками

7. Лимфоциты — это:

а) неспецифический фактор иммунной системы

б) специфический фактор иммунной системы

в) гуморальный фактор иммунной системы

г) иммунный комплекс

д) все перечисленное

8. Т-лимфоциты происходят из:

а) унипотентного предшественника Т-лимфоцита костного мозга с последующим созреванием в тимусе и заселяющего тимус в антенатальном периоде:

б) из лимфоцитов лимфы

в) из пейеровых бляшек

г) из щитовидной железы

д) из всего перечисленного

9. Какие типы поверхностных маркеров иммунокомпетентных Т — и В-лимфоцитов различают:

а) маркеры возраста, активности

б) маркеры возраста, характерного взаимодействия

в) маркеры возраста, функционального различия, принадлежности

г) маркеры возраста, приоритета

д) маркеры возраста, приоритета, активности

10. Основные цитокины — регуляторы кроветворения:

а) эритропоэтин

б) все верно

в) интерлейкин-3

г) интсрлейкин-9

д) интерлейкин-11

1. в 5. в 9. в

2. в 6. а 10. б

3. б 7. б

4. б 8. а

Клеточный иммунитет — Современные принципы оценки иммунной системы в клинике — Коррекция иммунитета у больных раком предстательной железы

О состоянии клеточного иммунитета принято судить по количественным тестам определения Т-лимфоцитов и их популяций, пролиферативной активности лимфоцитов в реакции бласттрансформации на митогены, антигены и аллогенные клетки, по реакции торможения миграции макрофагов, а также по кожной реакции ГЧЗТ в ответ на введение различных антигенов.

Метод спонтанного розеткообразования. Самым удобным и распространенным методом количественного определения Т-лимфоцитов в периферической крови является тест розеткообразующих лимфоцитов. Известно, что на мембранах Т-лимфоцитов имеются рецепторы к эритроцитам барана.

В связи с этим суспензию лимфоцитов инкубируют с определенным количеством эритроцитов барана, а затем микроскопируют для выявления процента розеткообразующих клеток. Розеткообразующей клеткой считается лимфоцит с прикрепленными к нему тремя и более эритроцитами. У здоровых мужчин количество Т-лимфоцитов составляет 40 — 90% лимфоцитов или 600 — 2500 клеток в 1 мм3 крови.

Понижение числа Т-лимфоцитов указывает на наличие иммунодефицита по Т-системе и является показанием к применению иммуностимулирующих средств.

Использование анти-Т-сывороток (реакция лизиса с анти-Т-сыворотками) или меченных изотопами моноклональных антител в условиях люминесцентной микроскопии являются наиболее точными методами определения количества Т-лимфоцитов. Среди Т-лимфоцитов различают шесть субпопуляций: хелперы, супрессоры, эффекторы, амплифайеры, дифференцирующие и клетки памяти. Важное значение для клиники имеет определение хелперов и супрессоров.

Выявление функционально различных субпопуляций Т-клеток основано на том, что мембраны Т-хелперов (мю-клетки) несут на себе рецепторы к Fc-фрагментам иммуноглобулина М, а мембраны Т-супрессоров (гамма-клетки) — к Fc-фрагментам иммуноглобулина G. Т-мю- и Т-гамма-лимфоциты подсчитывают среди выделенныхТ-клеток постановкой двойного теста розеткообразовання на первом этапе с эритроцитами барана, на втором — с эритроцитами быка, нагруженными специфическими антителами иммунноглобулинов класса М и G.

Для оценки субпопуляций Т-лимфоцитов используют также тест розеткообразования в присутствии теофиллина. Теофиллинрезистентная субпопуляция Т-лимфоцитов обогащена Т-хелперами, теофиллинчувствительная — наиболее точной является методика определения Т-хелперов и Т-супрессоров с помощью моноклональных антител (ОКТ-4,8).

Реакция бласттрансформации лимфоцитов (РБЛ). Этим способом определяют пролиферативную активность лимфоцитов, активно синтезирующих ДНК в период превращения в бластоподобные клетки. О бласттрансформации лимфоцитов судят по скорости синтеза ДНК с помощью включения радиоактивной метки Н3-тимидина. Для определения функциональной активности Т-лимфоцитов в качестве активатора реакции используют ФГА, а В-лимфоцитов — митоген лаконоса и некоторые микробные эндотоксины. Реакция торможения миграции макрофагов. Метод предполагает постановку реакции в системе in vitro. Сенсибилизированные лимфоциты при контакте со специфическим антигеном выделяют в культуральную среду медиатор, который тормозит миграцию макрофагов.

По величине уменьшения торможения миграции макрофагов судят о степени сенсибилизации лимфоцитов. Обычно в культуральную ячейку помещают капилляр, заполненный перитонеальными клетками, мигрирующими из него по стеклу в окружающую питательную среду. По площади, занятой мигрирующими клетками, количественно оценивают степень миграции.

Если, например, в капилляре находились макрофаги туберкулинположительных доноров и в ячейку добавляли туберкулин, то миграция макрофагов резко угнетается. Удаление примеси лимфоцитов из взвеси макрофагов предотвращает угнетение миграции. Очищенная взвесь сенсибилизированных лимфоцитов в присутствии антигена угнетает миграцию нормальных несенсибилизированных макрофагов.

Для этого достаточно добавить 1 % сенсибилизированных лимфоцитов. Продукция фактора, подавляющего миграцию макрофагов лимфоцитами от сенсибилизированного донора после стимуляции клеток антигенами in vitro очень точно коррелирует со степенью сенсибилизированности донора. При обследовании больных интенсивность продукции фактора, угнетающего миграцию макрофагов лимфоцитами, служит ценным показателем наличия и выраженности состояния сенсибилизированности замедленного типа к тому или иному антигену.

Реакция гиперчувствительности замедленного типа. Сущность этой реакции связана с накоплением сенсибилизированных к тому или иному антигену Т-лимфоцитов. В качестве антигенов для постановки кожных проб ГЧЗТ чаще всего используют туберкулин, кандидин, трихофитии, стрептокиназу-стрептодорназу и др.

Положительные кожные пробы являются интегральными показателями реактивности Т-системы.

Отсутствие или слишком слабая реакция при постановке кожных проб указывает на угнетение Т-звена иммунитета. Для правильного вывода необходимо иметь набор не менее чем из 4 — 5 антигенов.

Биопсия лимфатических узлов и гистологическая оценка тимусзависимых областей и вилочковой железы. Эти тесты ставят в сложных для диагностики случаях при подозрении на комбинированные иммунодефициты и злокачественные опухоли.

«Коррекция иммунитета у больных ракомпредстательной железы», В.А.Савинов

Популярные статьи раздела

www.medchitalka.ru

3.4.Методы оценки т – и б-клеточного звена системы иммунитета

Для выявления и подсчета Т-и В-лимфоцитов наиболее точными

являются методы, состоящие в выявлении поверхностных маркеров —

антигенов системы CD, которые были рассмотрены в разделе 13.1.

К этим антигенам биопромышленность готовит стандартные моноклональные

антитела и наборы реактивов, позволяющие в имму-

нолюминесцентных и цитотоксических тестах (см. далее) выявить Ти

В-лимфоциты, их субпопуляции, другие клетки иммунной системы.

Так, маркером Т-лимфоцитов служит антиген CD3, В-лимфоцитов —

CD22, хелперных Т-лимфоцитов — CD4, цитотоксических лимфоцитов

— CD8, естественных киллеров — CD 16, CD56.

Т- и В лимфоциты выявляют также по их способности фиксировать

на своей поверхности эритроциты барана или мыши, образуя

видимые под микроскопом структуры, именуемые розетками

(см. рис. 13.4). В-лимфоциты, обладающие рецепторами для иммуноглобулина

G и комплемента могут быть выявлены также по способности

формировать розетки с эритроцитами, нагруженными

этими белками. Содержание в крови здорового взрослого человека

Т-клеток — 4 0-70%, В-лимфоцитов — 10-30% общего числа лимфоцитов.

Некоторые лимфоциты (около 5%) не имеют маркеров Тили

В-клеток. Это нулевые лимфоциты, утратившие рецепторы. Их

число возрастает при некоторых заболеваниях.

Кроме того, к тестам 1-го уровня относится определение концентрации

сывороточных иммуноглобулинов IgM, IgG и IgA. Для

этого используются антисыворотки к тяжелым цепям иммуноглобулинов

разных классов, реакция преципитации (тест иммунодиффузии

— см. 19.2) или нефелометрия и турбидометрия, выявляющие

взаимодействие иммуноглобулина с антителами по светорассеянию

или мутности. Уровень сывороточных иммуноглобулинов отражает

функциональное состояние В-системы иммунитета.

Для оценки факторов неспецифической защиты организма определяют

фагоцитарную активность лейкоцитов крови. О фагоцитарной

активности судят по способности клеток к фагоцитозу нейтральных

частиц латекса, эритроцитов или микробных клеток. При этом

вычисляют процент фагоцитирующих клеток (фагоцитарное число) и

среднее число частиц поглощенных одним фагоцитом (фагоцитарный

индекс).

Тесты 2-го уровня позволяют провести более тщательный анализ

для уточнения характера дефекта, выявленного на предыдущем этапе

с помощью ориентировочных тестов. К ним относится определение

субпопуляций Т-лимфоцитов (CD4+ и CD8+), их соотношений, оценка

их функциональной активности, супрессорного потенциала, анализ

цитокинов и их рецепторов. Функциональная активность лимфоцитов

может быть оценена по количеству бластных форм, нарастающих

после активации клеток.

Потенциальную способность лимфоцитов к активации оценивают

после стимуляции митогенами, фитогемагглютином и др., культивируемых

вне организма клеток. Количество бластных форм может

быть определено при микроскопии. Более точен и чувствителен радиометрический

метод, оценивающий интенсивность включения радиоактивных

предшественников (тимидина) в ДНК культивируемых

клеток. Для оценки иммунной защиты слизистых используется определение

секреторных иммуноглобулинов IgA.

Уровень активности фагоцитов оценивают по их способности к

ферментативной обработке поглощенных клеток. Наиболее распространен

так называемый НСТ-тест, основанный на выявлении способности

клеток восстанавливать бесцветный реактив нитросиний тетразоль

в краситель, окрашивающий активную клетку в синий цвет.

studfiles.net

Оценка В-системы иммунитета (гуморальный иммунитет).

Для оценки В-системы иммунитета применяют несколько методов.

Определение В-лимфоцитов в крови. Используют три свойства лимфоцитов этого типа.

Наличиерецепторов к комплементу дает возможность подсчитать так называемые комплементарные розетки, т.е. лимфоциты, образующие розетки с эритроцитами, несущими на своей поверхности комплекс антитело — комплемент (ЕАС-розеткообразование). К розеткообразованию способны не только лимфоциты, но и гранулоциты. И. Вонг, А. Уилсон в 1975 г. описали технику постановки ЕА- и ЕАС-розеткообразования нейтрофилами, что доказало наличие у этих клеток Fс-рецепторов. В 1976 г. И. В. Петрова и соавт. описали способность нейтрофилов к спонтанному розеткообразованию с эритроцитами барана и было показано, что эта субпопуляция нейтрофилов резко возрастает при иммунодепрессивной терапии. По аналогии с лимфо- цитами нейтрофилы делят на спонтанные розеткообразующие клетки, комплементарные розеткообразующие клетки и нулевые. У здоровых людей спонтанных розеткообразующих нейтрофилов имеется от 25 до 35%, а комплементарных — от 14 до 20%.

рис. 1. Розеткообразование В- клеток.

Наличие у В-лимфоцитов рецепторов к Fс-фрагменту иммуноглобулинов приводит к тому, что они адсорбируют на себе агрегированный γ-глобулин. Выявить В-лимфоциты можно с помощью флюоресцентного или радиографического метода, используя меченые агрегаты γ-глобулинов. Человеческие В-лимфоциты образуют розетки с мышиными эритроцитами. Наконец, с помощью иммунофлюоресцентного метода Кунса, применяя антиглобулиновые сыворотки, можно обнаружить и подсчитать все лимфоциты, несущие иммуноглобулиновые детерминанты, т. е. В-лимфоциты. При этом можно провести дифференцированный подсчет клеток, несущих IgМ-, IgG или 1gА-детерминанты. Так же необходимо определять не только процент В-клеток, но и их абсолютное количество в 1 мкл крови.

Определение в крови уровня иммуноглобулинов. Проводят определение суммарной концентрации иммуноглобулинов и количество иммуноглобулинов разных классов. Первое осуществляется методом высаливания сульфа-том цинка с последующей турбидиметрической оценкой, электрофорезом или иммуноэлектрофорезом. Нормальный уровень суммарных иммуноглобулинов у человека составляет от 10 до 20 г/л. Определение количества IgМ, IgG и IgА чаще всего осуществляется методом радиальной иммунодиффузии по Манчини. IgЕ определяется радиоиммунологическим методом. Верхняя граница нормы составляет 0,0005 г/л.

Определение наличия и уровня изогемагтлютининов в сыворотке крови, а также естественных (нормальных) антител к широко распространенным бактериям и вирусам. В качестве антигенов можно использовать кишечную палочку, стафилококковые токсины, вирус герпеса и др. Следует иметь в виду, что ά- и β-изогемагглютинины относятся к IgМ.

Исследование антителогенеза (первичного и вторичного ответа) после акти-вной иммунизации несколькими убитыми вакцинами. Применяют коклюшную и убитую полиомиелитную вакцины, дифтерийный и столбнячный анатоксины, полисахаридные антигены, выделенные из пневмококков, менингококков и бактерий кишечной группы. Необходимость использования нескольких антигенов связана с генетически детерминированной конкретностью иммунного ответа. Получение низкого иммунного ответа на какой-то один антиген может оказаться результатом того, что данный индивидуум относится к низкоотвечающему на данный антиген генотипу. Реакция на другие антигены может быть нормальной. Вот почему диагноз функциональной неполноценности В-системы можно поставить только при угнетении иммунного ответа на несколько разных антигенов.

Исследование катаболизма иммуноглобулинов в организме. В кровь вводят меченый препарат человеческого иммуноглобулина. Клиренс метки из крови и ее накопление в моче и испражнениях дают возможность определить период полужизни иммуноглобулина. В норме период полужизни IgG равен 24 дням. При экссудативной энтеропатии, нефрозах и некоторых других заболеваниях возникает состояние гиперкатаболизма иммуноглобулинов. Для установления факта избирательного их гиперкатаболизма параллельно определяют период полужизни меченого альбумина.

Биопсия лимфатических узлов, костного мозга, участков слизистой оболочки кишечника. Эту процедуру проводят с целью гистологического обнаружения плазматических клеток, наличия и структуры лимфоидных фолликулов. Кожные реакции, выявляющие гиперчувствительность немедленного типа. К таким пробам относится ШИК-реакция. У людей, иммунизированных против дифтерии, в организме которых содержатся антитела против дифтерийного токсина, внутрикожная инъекция этого токсина не приводит к развитию типичной эритемы.

Стимуляция биосинтеза иммуноглобулинов В-лимфоцитами in vitro. Оценка функциональной активности В-лимфоцитов из крови человека возможна благодаря тому, что некоторые митогены, например митоген лаконоса, обладают способностью вызывать поликлональную стимуляцию В-лимфоцитов. «Валовую» продукцию В-клеток, синтезирующих иммуногло-булины, определяют в культуральной жидкости радиоиммунологическим методом через 7—12 дней культивирования лимфоцитов с митогеном.

рис. 2. Гуморальный иммунный ответ.

В-лимфоциты вырабатывают антитела, помогая распознавать и удалять чужеродные антигены (переносимые бактериями или вирусами). Им помогают циркулирующие в крови Т-лимфоциты и макрофаги.

а) Вирусные частицы через поверхностные клетки проникают в ткань и размножаются.

б) Макрофаги пожирают вирусные частицы,

в) Макрофаги передают антигены циркулирующим в крови Т-лимфоцитам. Это приводит к мобилизации дополнительного количества Т- и В-лимфоцитов.

г) В-лимфоциты распадаются на плазматические В-клетки, которые производят антитела, специфичные для проникшего вируса, и В-клетки памяти.

д) Циркулирующие в крови антитела взаимодействуют с вирусными частицами.

е) Макрофаги распознают и пожирают вирусы, защищая организм от инфекций.

рис.3. Взаимодействие клеток при иммунном ответе.

Рецептор Т-хелпера распознаёт антигенную детерминанту (эпитоп) вместе с молекулой ГКГ 11 класса, выставленные на поверхности Аг-представляющей клетки. В молекулярном взаимодействии участвует дифференцировочный Аг Т-хелпера СD4. В результате подобного взаимодействия Аг- представляющая клетка секретирует ИЛ-1, стимулирующий в Т-хелпере синтез и секрецию ИЛ-2, а также синтез и встраивание в плазматическую мембрану того же Т-хелпера рецепторов ИЛ-2. ИЛ-2 стимулирует пролиферацию Т-хелперов и активирует цитотоксические Т-лимфоциты. Отбор В-лимфоцитов произво-дится при взаимодействии Аг с Fаb -фрагментами Ig М на поверхности этих клеток. Эпитоп этого Аг в комплексе с молекулой ГКГ II класса узнаёт рецептор Т-хелпера, после чего из Т-лимфоцита секретируются цитокины, стимулирующие пролиферацию В-лимфоцитов и их дифференцировку в плазматические клетки, синтезирующие АТ против данного Аг. Рецептор цитотоксических Т-лимфоцитов связывается с антигенной детерминантой в комплексе с молекулой ГКГ I класса на поверхности вирус- инфицированной или опухолевой клетки. В молекулярном взаимодействии участвует диффе-ренцировочный Аг цитотоксического Т-лимфоцита СD 8. После связывания молекул взаимодействующих клеток цитотоксический Т-лимфоцит убивает клетку-мишень.

Рис. 5. Трехклеточная система взаимодействия при развитии гуморального иммунного ответа.

В-лимфоцит получает специфическую информацию об антигене от поглотившего чужеродный материал макрофага и неспецифическую — от индуктора иммунопоэза (ИИ), секретируемого Т-лимфоцитом после распознавания антигена. В условиях, когда кооперируют все три типа клеток, развивается полноценный иммунный ответ. Если В-клетка получает только информацию об антигене от макрофага, а помощь со стороны Т-клетки отсутствует, то индуцируется специфическая неотвечаемость — толеран-тность. При действии на В-клетку только ИИ происходит синтез неспецифических иммуноглобулинов.

Рис. 6. Взаимодействие между клетками вилочковой железы (источника Т-клеток) и клетками костного мозга (источника В-клеток) при индукции гуморального иммунного ответа.

Гуморальный ответ развивается как комплексный процесс, который включает несколько типов клеток. Введение облученным мышам только клеток костного мозга — ККМ (В-лимфоцитов) или только клеток вилочковой железы — КВЖ (Т-клеток) не обеспечивает развитие иммунного ответа достаточной силы. В то же время введение смеси этих клеток приводит к формированию интенсивной продукции антител к эритроцитам барана. Причем ответ при таком совместном введении клеток значительно выше, чем сумма ответов при раздельном введении клеток различного происхождения. Иначе кооперация различных типов клеток приводит к синергическому эффекту. Ответ оценивали по количеству бляшкообразующих клеток (БОК) в селезенке.

Рис. 7. Развитие гуморального иммунного ответа.

«Суммарная» схема, учитывающая субпопуляции лимфоцитов, которые участвуют в индукции антителогенеза, переключение синтеза IgМ на синтез IgG и создание клеток памяти. Захваченный макрофагами (МФ) антиген (АГ) выводится на клеточную поверхность в иммуногенной форме. В реакцию распознавания АГ вступают «ранние» Т-хелперы с фенотипом, которые способствуют созреванию «поздних» Т-хелперов, помогающих антителопродукции. Развитие первичного IgМ-ответа не требует помощи со стороны Тх Lуt1. Для накопления плазматических клеток, продуцирующих IgМ-антитела (ПК IgМ), очевидно, достаточно простого распознавания АГ на поверхности МФ. Однако помощь Тх Lуt1необходима для внутриклеточного переключения синтеза IgМ на синтез IgG, накопления плазматических клеток, синтезирующих и секретирующих IgG (ПК IgG) и вступления клеток памяти (КП IgG) во вторичный иммунный ответ.

Клеточный иммунный ответ характеризуется пролиферацией коммитированных иммунокомпетентных клеток, реагирующих с Аг в комплексе с молекулой ГКГ I класса на поверхности чужеродных клеток или эндогенными иммуногенами в комплексе с молекулой ГКГ I класса на поверхности собственных вирус- инфицированных и опухолевых клеток. В клеточном иммунном ответе участвует цитотоксический Т-лимфоцит. Цитотоксический Т-лимфоцит (Тс). Предъявленный на поверхности клетки-мишени Аг в комплексе с молекулой ГКГ I класса связывается с рецептором цитотоксического Т-лимфоцита. В этом процессе участвует молекула СD8 клеточной мембраны Тс. Секретируемый Т-хелперами ИЛ-2 стимулирует пролиферацию цитотоксических Т-лимфоцитов. Уничтожение клетки-мишени. Цитотоксический Т-лимфоцит распознаёт клетку-мишень и прикрепляется к ней. В цитоплазме активированного цитотоксического Т-лимфоцита присутствуют мелкие тёмные органеллы, напоминающие запасающие гранулы секреторных клеток. Гранулы концентрируются в той части Т-киллера, которая расположена ближе к месту контакта с клеткой-мишенью. Параллельно происходят переориентация цитоскелета и смещение в эту область комплекса Гольджи, в котором и формируются гранулы. В них содержится цитолитический белок перфорин.

Выделяемые Т-киллером молекулы перфорина полимеризуются в мембране клетки-мишени в присутствии Са2+. Сформированные в плазматической мембране клетки-мишени перфориновые поры пропускают воду и соли, но не молекулы белка. Если полимеризация перфорина произойдет во внеклеточном пространстве или в крови, где в избытке имеется кальций, то полимер не сможет проникнуть в мембрану и убить клетку. Специфическое действие Т-киллера проявляется только как результат тесного контакта между ним и клеткой-мишенью, который достигается за счёт взаимодействия Аг на поверхности жертвы с рецепторами Т-киллера. Сам Т-киллер защищен от цитотокси-ческого действия перфорина. Механизм самозащиты неизвестен. Альтернативный механизм уничтожения клетки-мишени, согласно которому цитотоксические Т-лимфоциты и NK-клетки являются источником сигнала, который запускает уже предсуществующую суицидальную программу в клетке-мишени. Действие этого сигнала усиливают глюкокортикоиды.

| следующая лекция ==>
  |  

Похожие статьи:

poznayka.org

Способ определения активности клеточного иммунитета

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано в медицинской практике в качестве оценочного теста на определение у людей индивидуальной дифференцированной активности систем Т- и В-лимфоцитов. Способ включает внутрикожное введение митогена и параллельно с ним плацебо. Затем измеряют диаметр папулы в кожных реакциях немедленного и замедленного типа. Определяют выраженности функции систем Т- и В-лимфоцитов по диаметру папулы на введение митогена по сравнению с введением плацебо. При этом в качестве митогена вводят антилимфоцитарный иммуноглобулин в дозе от 10 до 850 лимфотоксических единиц. При диаметре папулы от 20 до 28 мм в реакции немедленного типа определяют функцию системы В-лимфоцитов периферической крови как выраженную реакцию. При диаметре папулы от 16 до 25 мм в реакции замедленного типа определяют функцию системы Т-лимфоцитов как выраженную реакцию. Перечисленные показатели позволяют определить активность клеточного иммунитета как нормальную. Способ позволяет назначить иммунокорригирующую терапию лицам с умеренно выраженным иммунодефицитом, тем самым снизить проявление астеновегетативного синдрома и аллергических реакций, снизить заболеваемость гриппом и острыми респираторными вирусными инфекциями.

Изобретение относится к клинической иммунологии и может быть использовано в медицинской практике в качестве оценочного теста на определение у людей индивидуальной дифференцированной активности систем Т- и В-лимфоцитов, как показателей клеточного иммунитета или иммунологической реактивности.

Иммунологическую реактивность человеческого организма можно определить чисто иммунологическими методами: начиная с момента выделения пула лимфоцитов из образцов крови с последующим разделением на фракции Т- и В-лимфоцитов (фекол-гепаковый метод), выделением отдельных фракций внутри Т-лимфоцитов (хелперы, супрессоры, активаторы и т.д.), идентификацией современными методами иммуноферментного анализа с моноклональными антителами к каждому конкретному типу, постановкой реакций розеткообразования, бласттрансформации и миграции лимфоцитов. Перечисленные методы дают значительный объем информации о характеристике индивидуального клеточного иммунитета, однако их постановка занимает достаточно длительный промежуток времени, очень дорогостоящая ввиду высокой стоимости оборудования и реактивов, а следовательно, не имеет широкого применения в повседневной медицинской практике. Кроме того, в клинической иммунологии до настоящего времени нет четких критериев оценки нормального иммунологического статуса, т. к. пределы колебаний количественных показателей весьма значительны.

Известны способы для оценки состояния клеточного иммунитета путем постановки кожных проб. В частности, в клинических исследованиях по определению индивидуальной чувствительности к различным антибиотикам и другим аллергенам, когда внутрикожно вводят 0,1- 0,2 мл того или иного исследуемого материала. На месте его введения появляются покраснение, отечность и уплотнение кожи, которые и принято называть папулой. Реакцию учитывают по диаметру папулы вначале через 15-20 минут (реакция немедленного типа), а затем аналогично через 24- 48 часов (реакция замедленного типа). В реакции немедленного типа наряду с рядом факторов неспецифического иммунитета, наиболее активно проявляется реакция В-лимфоцитов. В реакции же замедленного типа отражаются в основном функциональные характеристики системы Т- лимфоцитов. Информацию об иммунологической реактивности макроорганизма можно получить и в ходе постановки кожных проб с препаратами туберкулина, паротитного антигена и некоторых других. Однако, в этих случаях, наличие в сыворотке крови специфических антител к возбудителям туберкулеза и эпидемического паротита препятствует получению достоверного ответа на уровень активности как Т-, так и В-лимфоцитов.

Более достоверные результаты могут быть получены при направленном определении активности системы лимфоцитов в случае использования для постановки кожной пробы такого митогена, как фитогемагглютинин (1). Однако для широкого клинического применения препарат не может быть использован ввиду того, что он может вызывать агглютинацию эритроцитов.

Таким образом, используемые с различной частотой в медицинской практике кожные пробы, практически не дают достоверной информации об уровне иммунологической реактивности человеческого организма.

Задача, на решение которой направлено заявляемое изобретение, состоит в разработке способа определения активности клеточного иммунитета, позволяющего достоверно, информативно и в краткие сроки определять уровень дифференцированной активности Т- и В-лимфоцитов.

Сущность изобретения состоит в том, что экспресс-определение уровня дифференцированной активности Т- и В-лимфоцитов проводят путем постановки кожной пробы препаратом антилимфоцитарного иммуноглобулина (АЛГ) в объеме 0,1 мл, содержащем 10 лимфотоксических единиц (ЛЕ) (ВФС-42-1598-86).

Способ осуществляют следующим образом: в кожу сгибаемой медиальной поверхности предплечья с помощью одноразового шприца вводят препарат АЛГ в дозе 10 ЛЕ (стандартный препарат, выпускаемый промышленным образом, содержит 1000-12000 ЛЕ, поэтому его предварительно — разводят в 100 раз стерильной водой для инъекций). Это оптимальная доза, хотя реакцию вызывают как большие, так и меньшие дозы АЛГ. Меньшая доза может быть использована в случае определения активности системы лимфоцитов у людей, страдающих различными аллергическими проявлениями, а большая доза — у людей с выраженными явлениями иммунодефицита.

При проведении теста измерялась величина папулы по двум взаимно перпендикулярным направлениям.

Для контроля в кожу сгибаемой медиальной поверхности другого предплечья одноразовым шприцем внутрикожно вводили плацебо (лошадиный иммуноглобулин в разведении 1: 100 на воде для инъекций). Нормальным явлением считали отсутствие папул в реакциях как немедленного, так и замедленного типа. Если внутрикожное введение АЛГ вызывает реакции замедленного типа, немедленного типа, которые проявляются в реакции гиперчувствительности, то это отражает активность клеточного иммунитета.

Способ поясняется следующими примерами: Пример 1. Высшее учебное заведение Т. Группа студентов в количестве 26 человек, клинически здоровых, не имевших в анамнезе болезней крови, наследственных и каких-либо хронических заболеваний, а также каких бы то ни было аллергических проявлений, в возрасте от 20 до 25 лет, обоих полов. Постановку кожной пробы осуществляли путем внутрикожного введения 10 ЛЕ препарата АЛГ. В качестве плацебо в другую руку внутрикожно вводили лошадиный иммуноглобулин в разведении 1:100. При учете результатов через 20 минут после введения АЛГ (реакция немедленного типа) выявлен средний диаметр папулы, равный 25 мм, при колебаниях от 20 до 28 мм, что соответствует достаточной активности системы В-лимфоцитов периферической крови. Учет результатов через 24 часа (реакция замедленного типа) после введения АЛГ выявил средний диаметр папулы в 20 мм при колебаниях от 16 до 25 мм, что, в свою очередь, соответствует достаточной активности системы Т- лимфоцитов. При этом на месте введения плацебо ни через 20 минут, ни через 24 часа папулы выявлено не было. Таким образом, среди лиц, клинически здоровых, не страдающих системными или хроническими заболеваниями, а также аллергическими проявлениями, не выявлено недостаточности функций систем Т- и В-лимфоцитов, что подтверждает выраженную реакцию клеточного иммунитета и позволяет быстро (уже через 24 часа) и достоверно оценить состояние систем как Т-, так и В-лимфоцитов как удовлетворительное.

Пример 2. Завод по производству акрилсодержащих полимеров С. 72 работника, занятых непосредственно производством акрилсодержащих полимеров и изделий из них, в возрасте от 26 до 52 лет со стажем работы на данном предприятии от 4 до 12 лет, обоих полов, страдающие частыми заболеваниями гриппом и острыми респираторными заболеваниями, а также гнойно-воспалительными заболеваниями кожных покровов. Постановку кожной пробы осуществляли путем внутрикожного введения препарата АЛГ в дозе 10 ЛЕ. Учет результатов выявил отсутствие папулы у 52 обследованных как через 20 минут, так и через 24 часа, что свидетельствует о подавленном состоянии функций систем Т- и В- лимфоцитов. Положительная реакция немедленного типа обнаружена у 18 человек, причем у 13 из них диаметр папулы находился в пределах от 5 до 10 мм, что говорит о частичной недостаточности функции системы В- лимфоцитов. У 5 обследованных диаметр папулы находился в пределах 20- 22 мм, что подтверждает выраженную реакцию системы В-лимфоцитов и соответствует норме. Положительная реакция замедленного типа отмечена лишь у 2 обследованных. Средний диаметр папулы составлял 20 мм, что подтверждает выраженную реакцию системы Т-лимфоцитов. Таким образом, из общего числа обследованных лишь 5 человек ( что составляет менее 7 процентов) имеют нормальную функцию клеточного иммунитета, проявляющуюся в достаточно выраженной активности систем Т- и В- лимфоцитов.

Пример 3. Клиника сосудистой хирургии М. 50 больных, страдающих ишемической болезнью сердца, атеросклерозом магистральных сосудов, облитерирующим эндартериитом, тромбозом, подлежащих оперативному лечению. Постановку кожной пробы осуществляли путем введения препарата АЛГ в дозе 10 ЛЕ за несколько дней до операции. Учет результатов реакции немедленного типа у пациентов, у которых папула либо отсутствовала вообще, либо была слабо выражена (средний диаметр в пределах 5-10 мм) позволил достоверно прогнозировать развитие осложнений атеросклеротического характера в виде тромбозов в ходе течения послеоперационного периода (в течение 3 недель). Учет результатов реакции замедленного типа у пациентов, у которых папула либо отсутствовала вообще, либо была слабо выражена (средний диаметр в пределах 3-7 мм) позволил достоверно прогнозировать развитие осложнений по типу присоединения вторичной инфекции в ходе течения послеоперационного периода. В тех же случаях, когда и через 20 минут, и через 24 часа регистрировали выраженность систем клеточного иммунитета (средний диаметр папул находился в пределах 20-25 мм в реакции немедленного типа и 16-25 мм в реакции замедленного типа) послеоперационное течение протекало гладко, практически без каких-либо осложнений.

Пример 4. Химическое предприятие по производству солей металлов (марганца, кобальта, магния, никеля, теллура, ванадия и др. ) К. 209 работников, занятых непосредственно в производственных цехах, обоих полов, со стажем работы на данном предприятии от 5 до 20 лет, со средним возрастом 41 год. Первичную постановку кожной пробы осуществляли путем внутрикожного введения препарата АЛГ в дозе 10 ЛЕ. Так как учет результатов выявил отсутствие папулы у 95 процентов обследованных как через 20 минут, так и через 24 часа, что свидетельствовало о выраженном подавлении реакций клеточного иммунитета, повторную постановку кожной пробы осуществляли путем внутрикожного введения 100 ЛЕ препарата АЛГ с целью определения степени выраженности иммунодефицита. Учет результатов этого исследования выявил отсутствие папулы у 15 человек как в реакции немедленного, так и замедленного типа, что позволило установить у этих обследованных ярко выраженное состояние иммунодефицита с высоким риском развития онкологических заболеваний. Это и было подтверждено в дальнейшем при детальном клиническом обследовании этой группы лиц. Наличие выраженной папулы (пределы размеров от 5 до 25 мм) как через 20 минут, так и через 24 часа свидетельствовали о частичном угнетении функций систем Т- и В-лимфоцитов. Полученные данные обследования легли в основу схемы назначения иммунокоррегируюшей терапии лицам с умеренно выраженным иммунодефицитом, в результате применения которой отмечено уменьшение проявлений астено-вегетативного синдрома и аллергических реакций, заметно снизилась заболеваемость гриппом и острыми респираторными вирусными инфекциями.

Источники информации.

1. Александер Дж.У., Гуд Р.А. Иммунология для хирургов. — М.: Мир, 1974, с. 71.

Способ определения активности клеточного иммунитета, включающий внутрикожное введение митогена и параллельно с ним плацебо, последующее измерение диаметра папулы в кожных реакциях немедленного и замедленного типа и определение выраженности функций систем Т- и В-лимфоцитов по диаметру папулы на введение митогена по сравнению с введением плацебо, как показателя активности клеточного иммунитета, отличающийся тем, что в качестве митогена вводят антилимфоцитарный иммуноглобулин в дозе 10 — 850 лимфотоксических единиц и при диаметре папулы 20 — 28 мм в реакции немедленного типа определяют функцию системы В-лимфоцитов периферической крови как выраженную реакцию, при диаметре папулы 16 — 25 мм в реакции замедленного типа определяют функцию системы Т-лимфоцитов как выраженную реакцию, что позволяет определить активность клеточного иммунитета как нормальную.

www.findpatent.ru

Глава 5. Иммунодиагностика. Оценка иммунного статуса

Неспецифические показатели иммунного статуса

Иммунодиагностика – это применение иммунологических реакций и методов с целью оценки иммунного статуса, лабораторной диагностики заболеваний, а также для идентификации антигенов.

Все методы иммунодиагностики делятся на 2 группы:

  1. Общие неспецифические методы, характеризующие состояние различных звеньев системы иммунитета: лимфоцитов, гранулоцитов, макрофагов, комплемента. Обычно их применяют для выявления дефекта в СИ, т.е. при иммунодефицитах.

  2. Специфические методы, позволяющие выявить антитела, иммунные Т-лимфоциты, антигены в организме человека или антигены возбудителя во внешней среде. Эти методы используют для диагностики инфекций, аллергии, аутоиммунных заболеваний.

Иммунный статус – это состояние СИ здорового или больного в определенный момент онтогенеза при конкретных условиях окружающей среды.

В частности, иммунный статус ребенка отличается от такового у взрослого человека. Также он изменяется под влиянием неблагоприятных воздействий.

Для оценки иммунного статуса применяют определение неспецифических и специфических показателей. Оценка иммунного статуса – это процесс получения комплекса количественных и функциональных показателей, отражающих состояние СИ. Она проводится с целью выявления природы иммунопатологии – иммунодефицитных и аллергических заболеваний.

Для этого сначала у больного собирают анамнез и проводят общеклиническое обследование. В нем важным является формула крови – количество лейкоцитов разных типов: нейтрофилов, эозинофилов, базофилов, моноцитов, лимфоцитов. Лейкоцитоз – увеличение общего количества лейкоцитов (более 9х109/л) часто наблюдается при инфекциях; лейкопении – снижение их количества (менее 4 х109/л) – при аутоаллергии; эозинофилия – увеличение количества (более 3%) эозинофилов при экзогенной аллергии и т.д. Однако этих данных обычно недостаточно и необходимо более детальное определение популяций, субпопуляций лейкоцитов и гуморальных факторов иммунитета.

Характеристика Т-лимфоцитов

1. Определяют общее количество лейкоцитов, формулу крови и количество лимфоцитов. В норме лимфоцитов 20-36% среди других лейкоцитов (около 2000 клеток в 1 мм3 крови).

2. Подсчитывают процент и количество Т-лимфоцитов. В норме среди лимфоцитов крови их 50-70% (1000-1400 клеток в 1 мм3 крови).

Простой метод определения Т-клеток: подсчет количества (процента) лимфоцитов, образующих при помощи CD2-АГ розетки с эритроцитами барана:

  • к взвеси лейкоцитов добавляют равный объем 1% взвеси отмытых эритроцитов барана и инкубируют при 370С 15 мин и ночь при 40С;

  • осадок ресуспензируют, добавляют раствор глютарового альдегида до конечной концентрации 0,06% для фиксации розеток и сразу делают мазки;

  • мазки высушивают, фиксируют спиртом и окрашивают по Романовскому-Гимзе;

  • подсчитывают процент Т-лимфоцитов, связавших три и более эритроцитов;

В настоящее время общую популяцию Т-лимфоцитов выявляют с помощью меченых моноклональных антител к СD-антигенам (СD2, СD3) в реакции иммунной флюоресценции (с учетом результатов на люминесцентном микроскопе, на проточном цитофлюориметре) или в реакции с частицами, покрытыми такими антителами. В норме у человека в крови среди всех лимфоцитов 55-80% являются Т-клетками.

3. Определяют содержание Т-хелперов и Т-супрессоров с помощью моноклональных антител к СD4 (Тx) и СD8 (Тc) антигенам.

У человека в норме в крови обнаруживается 33-46% Тx, 17-25% Тc, соотношение Тx/Тc=1,4-2.0 – иммунорегуляторный индекс. При заболеваниях этот индекс изменяется. Например, при СПИДе он уменьшается (0,04), т.к. угнетаются Тx (рецептором для вируса СПИДа является антиген Тx СD4). При аутоиммунных и аллергических заболеваниях индекс больше 2.0.

4. Для выявления активированных Т-клеток определяют рецепторы к ИЛ-2 (CD25), HLA-DR антигены и CD71 (рецептор для трансферрина).

5. Определяют уровень различных цитокинов в крови (обычно с помощью иммуноферментного анализа).

Исследуют также функциональные показатели Т-лимфоцитов: пролиферативную активность (см. РБТЛ, РПМЛ), цитотоксическую и цитокиновую активность. Показатели Т-лимфоцитов снижаются при Т-клеточных иммунодефицитах.

Характеристика В-лимфоцитов

1. Общее количество В-лимфоцитов можно определить с помощью моноклональных антител к антигенам СD19-СD22, СD72. Применяют также антитела к иммуноглобулинам, которые находятся на поверхности В-лимфоцитов. В-лимфоциты составляют 17-25% всех лимфоцитов (600-800 клеток в 1 мм3 крови). Иногда определяют В-лимфоциты, имеющие рецепторы к эритроцитам мыши (10-15%), составляющие лишь часть В-субпопуляции.

2. Продукты В-лимфоцитов – иммуноглобулины G, М, A классов в сыворотке крови и различных биологических жидкостях определяют с помощью радиальной иммунодиффузии в агаре – реакции преципитации по Манчини.

Для этого на одну стеклянную пластинку (или чашку Петри) наливают 2% агар, смешанный с антителами против IgG; на вторую пластинку – с антителами против IgМ, на 3-ю – против IgА. После застывания в агаре делают лунки диаметром 2 мм. В один ряд лунок каждой пластины вносят стандартную сыворотку с известной концентрацией IgG, IgМ, IgА. В другие лунки добавляют исследуемые сыворотки крови больных.

Рис. 5.1. Простая радиальная иммунодиффузия в агаре для определения антигенов (иммуноглобулинов)

Иммуноглобулины диффундируют в агар и на месте встречи с антителами, которые находятся в агаре, образуется зона кольца преципитации. Диаметр этого кольца зависит от концентрации Ig (чем больше Ig, тем больше диаметр). Измеряют диаметр зоны преципитации для трех разведений стандартной сыворотки и по ней на полулогарифмической бумаге строят график зависимости квадрата диаметра кольца преципитации (Д) от количества Ig в сыворотке крови (рис. 5.1). Затем измеряют диаметр кольца преципитации исследуемой сыворотки, наносят на построенный график и определяют концентрацию иммуноглобулина. Для определения секреторного IgA (в слюне и др.) используют аналогичный метод в двух вариантах: определяют IgA (a-цепь) и его секреторный компонент с помощью соответствующих антител.

Нормы у взрослых: 0,8-2 г/л IgM; 8,0-13,0 г/л IgG; 1,4-3,0 г/л IgA. У новорожденных уровень IgG близок к материнскому, IgM и IgA имеются в следовых концентрациях; к 4-6 мес. уровень IgG падает до 5-6 г/л, а затем увеличивается. При нормальном развитии детей уровень иммуноглобулинов к 2-м годам близок величинам их у взрослых.

Уровень секреторного IgA в слюне составляет 0,03-0,4 г/л.

При иммунодефицитах уровень иммуноглобулинов снижается (гипогаммаглобулинемия), а при стимуляции СИ и воспалении – повышается (гипергаммаглобулинемия).

Определяют уровень естественных (против антигенов групп крови, эритроцитов животных и др.) и иммунных (к распространенным бактериальным и вирусным антигенам, вакцинам) антител. Он снижен (или антитела отсутствуют) при иммунодефицитах

Характеристика системы гранулоцитов и моноцитов

1. Определяют количество лейкоцитов в крови и соотношение их видов (нейтрофилы, базофилы, эозинофилы, моноциты).

2. Оценивают поглотительную и переваривающую активность фагоцитов: к взвеси лейкоцитов или капле крови добавляют взвесь отмытой суточной культуры стафилококков. Готовят 3 пробы, инкубируют при 370С 1-ю пробу 45 мин, 2-ю — 60 мин, 3-ю — 90 мин. Делают мазки, высушивают их, фиксируют этанолом и окрашивают по Романовскому.

Определяют фагоцитарный индекс и фагоцитарное число.

Фагоцитарное число – это среднее количество частиц или микроорганизмов в одном фагоците (норма для стафилококков 6-12, кандид – 2-4).

Фагоцитарный индекс – это количество фагоцитов, участвующих в фагоцитозе, имеющих поглощенные частицы (норма – 60-80%).

Оценка показателей через разные промежутки времени позволяет оценить динамику фагоцитоза. В норме через 90 мин фагоцитарный индекс должен быть ниже, чем через 45 мин и 60 мин, в связи с перевариванием микробов. При нарушении переваривания он не меняется.

Переваривание микробов можно оценивать путем посева лизатов лейкоцитов (после инкубации с микробами) на питательные среды и подсчета выросших колоний. Метод предполагает использование в качестве объекта фагоцитоза живых микроорганизмов. После инкубирования с микробами (см. выше) фагоциты осаждают центрифугированием, отмывают и лизируют. Их лизаты высевают на твердую питательную среду. Переваривающую активность фагоцитов оценивают по числу выросших колоний.

Метаболическую активность фагоцитов определяют в тесте восстановления нитросинего тетразолия (НСТ-тест) после окраски их 0.25% раствором данного красителя. В норме нитросиний тетразолий окрашивает (диффузно и в виде глыбок голубого цвета) 15-18% нейтрофилов, при инфекциях их число увеличивается до 40% и более.

Показатели фагоцитов снижаются при соответствующих иммунодефицитах, а повышаются при благоприятном течении инфекции.

3. На фагоцитах с помощью моноклональных антител определяют антигены дифференцировки, активации и адгезии (СD14, СD11, СD18, HLA-DR и др.)

4. Выявляют рецепторы к С3 компоненту комплемента, к иммуноглобулинам и др.

5. Оценивают спонтанную и направленную миграцию (хемотаксис).

6. Определяют способность секретировать цитокины (ИЛ-1, ФНО и др.) и их уровень в крови.

Характеристика системы комплемента

1. Определяют гемолитическую активность комплемента в реакции гемолиза с использованием гемолитической системы. Эта система состоит из эритроцитов барана, обработанных гемолитической сывороткой.

Определение комплемента основано на способности продуктов его активации вызывать лизис эритроцитов, покрытых антителами. По степени гемолиза судят о гемолитической активности комплемента.

В качестве единицы измерения комплемента используется гемолитическая единица (СН50) – количество комплемента, вызывающее 50%-ный лизис 3% суспензии сенсибилизированных антителами эритроцитов при температуре 370С в течение 45 мин. Титрование комплемента сводится к определению количества СН50 гемолитических единиц в конкретном объеме сыворотки. Для этого к различным дозам сыворотки прибавляют стандартное количество сенсибилизированных эритроцитов. Затем, используя шкалу лизиса эритроцитов дистиллированной водой, находят количество СН50 единиц.

Степень гемолиза при титровании комплемента можно определять фотометрическими методами (с помощью спектрофотометра, фотоколориметра, нефелометра) или же визуально путем сравнения интенсивности гемолиза в опытных пробирках со стандартной шкалой лизированных эритроцитов.

2. Выявляют продукты активации С4а, С3а, С5а и др.

studfiles.net

С помощью метода «спонтанных» розеток (розеткообразование с эритроцитами барана) определяют количество Т-лимфоцитов в крови. Обязательным является расчет абсолютного количества розеткообразующих лимфоцитов в 1 мкл крови. Вычисление только их процента среди всех лим-фоцитов может привести к ошибке. Например, в норме среди лимфоцитов крови содержится 60% Т-клеток, а при В-лейкозах Т-лимфоцитов в крови

может быть около 1%, но это не значит, что имеется 60-кратное угнетение Т-системы иммунитета. Если общее количество лимфоцитов у данного больного в 60 раз больше, чем у здорового человека, то абсолютное число Т-лимфоцитов в его крови нормально.

Реакция бласттрансформации лимфоцитов под влиянием ФГА или в микст-культуре. Эту и предыдущую пробу необходимо проводить параллельно, поскольку при некоторых иммунодефицитах угнетение реакции бласттрансформации свидетельствует не о снижении уровня Т-лимфоцитов в крови, а об угнетении их функциональной активности. Например, при иммунодефиците с атаксией — телеангиэктазией регистрируется почти полное угнетение бласттрансформации при нормальном количестве Т-розеток среди лимфоцитов. До разработки метода «спонтанных» розеток угнетение бласттрансформации расценивали как показатель снижения
количества Т-лимфоцитов в крови.

Определение динамики бласттрансформации. Эту реакцию необходимо учитывать не в один какой-либо срок культивирования лимфоцитов, а в динамике с использованием разных доз митогена. Кривые зависимости время — эффект и доза — эффект лучше всего отражают данный вид функции-ональной активности лимфоцитов. Наиболее объективный учет бласттранс-формации во всех случаях требует применения радиоизотопной методики с определением включения меченых нуклеотидов в клетки. Оценка продукции лимфоцитами периферической крови гуморальных медиаторов клеточного иммунитета. Наиболее распространен тест подавления миграции макрофагов фактором, угнетающим их миграцию, выделяемым сенсибилизированными лимфоцитами под влиянием соответствующего антигена. С помощью этого метода можно установить сенсибилизацию организма к тому или иному антигену.

Постановка кожных реакцийгиперчувствительности замедленного типа на широко распространенные антигены (туберкулин, трихофитии и др.). Конечно, негативные реакции не могут служить доказательством неполно­ценности Т-системы иммунитета, так как организм может быть не сенсиби-лизирован к используемым препаратам. Контактная аллергия к динитро-хлорбензолу (ДНХБ). Этот гаптен при накожной аппликации вызывает развитие реакции гиперчувствительности замедленного типа. Повторное нанесение препарата дает типичную кожную реакцию. Поскольку вероят-ность контакта индивидуума с данным редким химическим соединением ничтожна, проба с ДНХБ служит весьма распространенным методом оценки способности организма развивать гиперчувствительность замедленного типа, т. е. функциональной активности Т- системы иммунитета.

Отторжение аллогенного кожного лоскута. Эта реакция также относится к гиперчувствительности замедленного типа и осуществляется в основном Т-лимфоцитами. Однако трансплантация чужеродной ткани приводит к сенсибилизированности организма по отношению к трансплантационным анти-генам, что может оказаться нежела­тельным при последующем лечении больного такими методами, как пересадка костного мозга, вилочковой железы и др.

Биопсия лимфатических узлов и гистологическая оценка тимусзависимых областей и вилочковой железы. Эти тесты ставятся в сложных для диагностики случаях при подозрениях на комбинированные иммунодефициты и злокачественные новообразования.

В 1981 г. Всемирная организация здравоохранения опубликовала Меморан-дум по правильному и неправильному применению широко используемых методов клинической иммунологии. Этот документ, составленный группой авторитетных клинических иммунологов, характеризует особенности показаний к применению наиболее часто используемых тестов. В документе выделяется два уровня значимости исследования — абсолютная необхо-димость и полезность. Анализируется 8 иммунологических тестов.

1. Количественная оценка иммуноглобулинов в сыворотке крови абсолютно необходима при подозрении на наличие первичного или вторичного иммуно-дефицита, а также для слежения за течением заболеваний при гамма-глобу-линотерапии. Количественная оценка сывороточных иммуноглобулинов полезна для отличия «доброкачественных» идиопатических моноклональных гаммапатий от миеломы. Определение уровня IgМ в пуповинной крови ново­рожденных полезно при подозрении на врожденную инфекцию.

2. Иммуноэлектрофоретический анализ иммуноглобулинов в биологических жидкостях абсолютно необходим при подозрении на наличие следующих болезней: миелома, макроглобулинемия Вальденстрема, болезни тяжелых цепей, амилоидоз, болезни, связанные с отложением иммуноглобулинов в тканях. Этот анализ также необходим при таких аномалиях, как наличие криоглобулинов, протеинурии типа Бенс- Джонса, повышенной вязкости сыворотки. Иммуноэлектрофорез полезен при некоторых им-мунопролиферативных заболеваниях.

3. Оценка уровня общего IgЕ абсолютно необходима только в одном редком случае (гипер-IgЕ-синдром, ассоциированный с эозинофилией и рецидиви-рующими инфекциями), но может быть полезна при дифференциации между IgЕ- и не IgЕ-опосредуемыми нарушениями, которые клинически неразличи-мы (риниты, бронхиальная астма, дерматиты и сыпи, пищевая неперено-симость). Измерение количества специфического IgЕ не является абсолютно необходимым ни при какой патологии. Этот тест не может полностью заменить аллергологический анамнез и кожные пробы. Оценка уровня специфического IgЕ полезна при тяжелых дерматитах или дермографизме, в случаях, когда терапия приводит к изменению кожных реакций, при очень сильных кожных реакциях и т. п.

4. Определение комплемента по тотальному тесту 50 % гемолитической активности является необходимым только при подозрении на генетически обусловленные дефекты в системе комплемента. Оценка по этому тесту или путем определения С3 и С4 компонентов комплемента полезна для слежения за течением болезни и эффективностью терапии при гломерулонефрите, при таких иммунокомплексных болезнях, как системная эритематозная волчанка, и некоторых формах васкулитов, а также при геморрагической лихорадке Денге.

5. Определение иммунных комплексов в биологических жидкостях не является абсолютно необходимым ни в каких клинических ситуациях. Их присутствие в сыворотке крови неспецифично для болезней иммунных комплексов. Повреждения тканей, индуцированные иммунными компексами, могут развиваться без определимых количеств циркулирующих в крови комплексов. Наоборот, присутствие комплексов в крови может не сопрово-ждаться наличием тканевых повреждений. Более ценным является прямой анализ проб тканей. Оценка иммунных комплексов может быть полезной для определения активности процесса при таких болезнях, как ревматоидный артрит и системная красная волчанка, и при контроле за эффективностью обменных переливаний плазмы и для прогноза течения таких опухолевых процессов, как острый лейкоз.

6. Определение аутоантител путем непрямой иммунофлюоресценции абсолютно необходимо как тест на наличие антиядерных антител при диагностике системной красной волчанки. Обнаружение антиядерных антител полезно для диагностики так называемых смешанных болезней соединительной ткани, хронического активного гепатита и прогрессивного системного склероза. Тест на тиреоидные аутоантитела необходим для диагностики хронического тиреоидита и микседемы взрослых. Определение других аутоантител методом непрямой иммунофлюоресценции полезно в конкретных нечастых случаях.

7. Определение количества В- и Т-клеток абсолютно необходимо для диагностики и слежения за течением первичных иммунодефицитов, а также для классификации лимфопролиферативных заболеваний. При этом желательно использовать одновременно несколько реагентов, например моноспецифические антииммуноглобулиновые антитела и моноклональные антитела против лимфоидных популяций. Изучение субпопуляций Т- и В-лимфоцитов полезно у отдельных пациентов.

8. Оценка ответа лимфоцитов на митогены как показатель клеточно — опосре-дованного иммунитета не может быть рекомендована как каждодневный (рутинный) метод. Его следует использовать только выборочно. Показатель единичного измерения, даже если он далеко выходит за пределы нормы, имеет очень малую клиническую ценность и не обязательно свидетельствует о нарушении клеточно-опосредованного иммунитета. Оценка этой формы иммунитета абсолютно необходима в случаях предполагаемого или дока-занного первичного иммунодефицита. Оценка клеточного иммунитета поле-зна для исследования вторичных иммунодефицитов, включая те, которые связаны с хроническими инфекциями, и для контроля за применением иммуностимулирующей терапии.

Дата добавления: 2016-09-06; просмотров: 650;

Похожие статьи:

Среди лабораторных методов, используемых в целях иммунодиагностики, особое место занимают: 

  • методы, основанные на детектировании клеток и молекул иммунной системы с помощью маркированных моноклональных антител (МАТ). В основе этих методов – получение с помощью гибридомной технологии моноклональных антител к конкретным молекулам. Полученные моноклональные антитела маркируют флуорохромом, радиоактивным изотопом или иным способом и, используя основное свойство антител – способность связываться с антигеном, детектируют исследуемые молекулы на отдельных клетках, биопсийных образцах тканей или в других материалах. Для детекции связывания исследуемой молекулы с МАТ нужно специальной оборудование: если МАТ маркировано флуорохромом, то регистрацию результатов осуществляют с помощью люминесцентного микроскопа, но эффективнее – с помощью проточного лазерного цитофлуориметра. Если МАТ маркированы радиоактивным изотопом, то результаты регистрируют с помощью счётчиков ионизирующего излучения, или с применением авторадиографии. Иммуноферментный метод, метод иммуноэлектронной микроскопии, иммуноцитохимии и иммуногистохимии также относятся к данной группе методов. Внедрение этой группы методов позволило проводить иммунофенотипирование для определения принадлежности клеток иммунной системы к той или иной субпопуляции, а также проводить качественное и количественное определение практически любых белковых молекул и гаптенов. Поэтому области применения этой группы методов далеко перешагнули пределы иммунодиагностики и даже медицины;
  • серологический метод. Этот метод также применяется на основе взаимодействия антиген-антитело, но в случае визуально детектируемого взаимодействия. Т.е. в тех случаях, когда взаимодействие антигена с антителом проходит как специфическую, так и неспецифическую фазу, формируя видимый невооружённым глазом макромолекулярный комплекс в виде агглютинатов или преципитатов (см. лекцию Антитела). Этот метод преимущественно используется для диагностики некоторых инфекционных заболеваний (для определения уровня антигенспецифических антител или антигенов возбудителя), для определения групп крови, а также для определения С-реактивного белка и некоторых других провоспалительных белков, циркулирующих в кровеносном русле в достаточно высокой концентрации. Серологический метод прост, не требует специального оборудования, но уступает предыдущей группе методов в точности, воспроизводимости, специфичности и разрешающей способности, поэтому постепенно утрачивает своё значение;
  • молекулярно-генетические методы (полимеразная цепная реакция – ПЦР, метод молекулярной гибридизации с использованием ДНК-, РНК-зондов, реакция секвенцирования). В основе этих методов — исследование отдельных генов, детекция мутаций. Молекулярно-генетические методы применяют для подтверждения первичных (врождённых) иммунодефицитов, для определения гаплотипа главного комплекса гистосовместимости при выявлении риска развития аутоиммунных процессов, для обнаружения в биологическом материале генома микроорганизмов и др.;
  • культурально-биологические методы. Это также большая группа методов, предполагающих применение в качестве вспомогательных реагентов клеток животных (эритроцитов барана, например), микроорганизмов (для определения фагоцитарной активности часто используются стафилококки, кандиды). Кроме этого в процессе проведения исследования применяется культивирование клеток иммунной системы в лабораторных условиях. Обычно эта группа методов применяется для оценки функциональной активности клеток иммунной системы.

Перечисленные методы в обычном режиме иммунодиагностики используются для определения иммунного статуса человека. Иммунный статус – это состояние иммунной системы в конкретный промежуток времени. Исторически сложилась 2-х-уровневая система оценки иммунного статуса:

  • На 1-м уровне используют самые простые тесты, позволяющие обнаружить выраженные изменения показателей.
  • 2-й уровень предполагает применение более совершенных методов и тестов, позволяющих получить более полную информацию о состоянии иммунной системы.

Однако в настоящее время этот подход также постепенно вытесняется из практики. Это связано с разработкой более совершенных технологий, а также продвижением в изучении основ развития патологии иммунной системы. Так, для исследования иммунного статуса всё чаще применяется иммунопатогенетический подход, когда в большей степени учитываются результаты клинического исследования и клинических лабораторных анализов и из всего спектра иммунодиагностических тестов выбираются наиболее показательные и специфичные:

  • для диагностики иммунодефицитных состояний после первичного клинического обследования проводят полное исследование иммунного статуса (см. лабораторный практикум по иммунологии для студентов 3 курса, лабораторную работу № 8). При подозрении на наличие первичного (врождённого) иммунодефицита диагноз подтверждают молекулярно-генетическим исследованием, направленным на детекцию мутаций или отсутствие конкретных генов. В случае вторичных иммунодефицитов инфекционного генеза диагноз подтверждают выявлением инфекционного агента (обычно в ПЦР или обнаружением антигенов возбудителя и антител к ним с помощью иммунохимического или серологического методов);
  • для диагностики лимфопролиферативных процессов широко применяются инструментальные методы, позволяющие визуализировать объёмное образование (опухоль) лимфатической системы, исследуют иммунологический фенотип лимфоцитов крови, клеток красного костного мозга и/или биоптата из обнаруженной опухоли. Фенотипирование клеток позволяет установить стадию их дифференцировки. Диагностика включает также анализ хромосом и молекулярно-генетическое исследование маркёров ряда опухолей лимфатической и кроветворной систем, а также секретируемых некоторыми видами опухолей продуктов (например, лёгких цепей иммуноглобулинов) с помощью различных вариантов иммунохимических методов. Показатели иммунного статуса в данном случае не имеют особого диагностического значения для подтверждения диагноза лимфопролиферативного процесса, но необходимы для представления о функционировании всех компонентов иммунной системы в условиях лимфопролиферативного заболевания;
  • для диагностики аллергий осуществляют определение специфичности главного патогенетического фактора – IgE, благодаря чему устанавливается, какое вещество является для пациента аллергеном. Для установления особенностей патогенеза аллергии определяют концентрацию в биологических материалах (крови, слюне, моче, слёзной жидкости, носовом секрете и проч.) биологически активных компонентов тучных клеток (гистамина, триптазы, химотриптазы и др.). Диагностическое значение имеет также исследование продукции интерлейкина-4 и ряда других показателей. Показатели иммунного статуса являются вспомогательными критериями, они, как правило, не имеют непосредственного отношения к аллергии;
  • для диагностики аутоиммунных заболеваний патогенетически важно определение аутоантител определённых специфичностей (иммунохимическим или серологическим методом), а также общего уровня иммуноглобулинов разных классов, концентрации ЦИК, определение активности системы комплемента, концентрации провоспалительных белков (С-реактивного белка, церулоплазмина, ревматоидного фактора и др.). При диагностике аутоиммунных заболеваний используют исследование биоптатов тканей, в которых определяют наличие фиксированных иммунных комплексов или их компонентов. Определение других параметров иммунного статуса не имеет определяющего значения в диагностике аутоиммунных процессов.

Результаты иммунодиагностического исследования в дальнейшем используют для установления нозологической формы заболевания и назначения лечения.

Добавить комментарий

Ваш e-mail не будет опубликован. Обязательные поля помечены *